你说的应该是real time pcr吧，注意rt其实是逆转录reverse transcription的缩写，和real time一定要分开来。
在做QRT-PCR时，一定要有内参，即在PCR时，每个标本都要做对应的内参，而且每次都是看家基因，一般用bate-actin，有时也用GAPDH。内参的选择：普通PCR内参的大小没有多大要求，但real time一般选择300bp以下。
RT-PCR：反转录PCR（reverse transcription-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA（cDNA），再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。QRT-PCR在RT-PCR体系中同时加入内参标基因的引物，使目的基因和内参基因在同一条件下同时扩增。
任意qRT-PCR实验的可靠性均可以通过在实验中引入一个不变的内参对照得到改善，这样做有助于改善qRT-PCR的样品间差异以及样品定量过程中的误差。一个好的对照，其表达水平应当在所分析的样品中保持不变。通常我们使用18S rRNA作为对照，因为它相比其他传统内参对照如-actin或GAPDH等表达水平变化更小。
扩增效率差有引物、试剂和pcr条件的原因。可以做温度梯度摸索实验，寻找最佳退火温度（扩增子的影响），还可以增加mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因。
PCR反应体系不是最优体系。尽量不要自己配置反应液，最好用试剂公司配好的MIX。PCR模板由阻碍物（比如total RNA）。必须要重新提取模板 标准品稀释不准确造成标曲斜率不正确。这个就需要你经常练习手法啦~如果上述调整过后还是很低则考虑重新设计引物的问题。
主要考虑是否在模板稀释过程中出现问题，是否存在高浓度样品污染低浓度样品的情况。具体的要看了你的扩增曲线、溶解曲线以及标准曲线的结果才能判断。其次题主提到的两个问题模板浓度过高会抑制PCR反应，可能会导致扩增效率降低。
重复性差：检查移液器和定量仪器，确保qPCR预混液混匀。多个熔解曲线：重新设计引物，采用梯度法优化PCR温度，检查引物二聚体，降低浓度，清除污染。Ct值过晚出现：调整PCR引物长度、更换模板，采用三步法扩增，重新设计引物，增加稀释度重复实验。
影响扩增效率的关键因素 PCR的效率取决于许多因素，包括以下方面：1）检测的性能。这取决于引物、模板的序列和结构。二级结构和分子间的相互作用都会降低PCR效率。2）样品基质。其中可能含有来自样品的抑制剂和其他干扰物质，或携带来自上游加工步骤的试剂。
1、pcr原始数据包括原始图片，甚至还有荧光定量（qRT-PCR）的原始数据。还有的机构要求有溶解曲线，扩增曲线，没有经过任何修饰的免疫组化、免疫荧光图片。其实在行内不论杂志社还是审稿人都对论文原始数据的重视度高了很多。
2、pcr原始数据包括原始图片，甚至还有荧光定量（qRT-PCR）的原始数据。还有的机构要求有溶解曲线，扩增曲线，没有经过任何修饰的免疫组化、免疫荧光图片。原始证物就是我们文章结果真实性的（证物）。
3、会。qpcr数据很灵敏，稍有改动就会有变化，造假之后整体数据会发生巨大变化，很容易就会被发现。pcr原始数据包括原始图片，甚至还有荧光定量。
4、原始数据（Raw data）：一次测序产生的全部原始数据。理论上，它们应该是没有经过任何过滤的，无论好坏。RawData 指未加工过的数据，即原原本本从磁盘上读入而未经过任何改动的数据。这个是自身就有的不需要你去处理它的。
5、准备测序反应体系，包括PCR产物、引物（通常与扩增时使用的引物相同）、测序试剂和缓冲液。将PCR产物和引物混合，使其浓度适当，并根据测序方法的要求进行处理。测序反应 使用自动测序仪或其他测序设备进行测序反应。这些设备通常基于几代或下一代测序技术。
6、实时定量QPCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。 见下图：（略）实时荧光定量PCR的优势： 设备由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。
